I första labborationsdagen har vi renat en rekombinant plasmid från en bakterie kulltur. ( e.coli bakterie).
Detta gjordes genom tillsättning av olika bufferts och upprepade centrifugeringar.
Syfte med detta var att ta bort kromosomal DNA, RNA och proteiner. Vi skulle ta bort allt utom plasmiden.
Sedan utfördes en spektrofotometrisk kontroll av DNA och protein föroreningar.
Detta gjordes genom en absorbans mätning vid två olika våglängder, 280 nm - som visade protein absorbansen och 260 nm - som visade DNA absorbansen.
Resultatet av absorbanserna dividerades och vi fick en kvot som var 1,65.
Kvoten hjälper oss att kontrollera hur rent plasmid DNA har vi fått.
Om kvoten är < 1,8 anses det att provet innehåller proteiner, d.v.s. är kontaminerad.
Vår kvot var 1,65, detta betyder att vi har spår av proteiner.
Spektrofotometria visar att provet är förorenad , men den visar inte hur mycket plasmid DNA vi har fått.
För att kunna veta om vi har plasmid DNA i provet, måste vi genomföra en elektrofores.
Hej Diana!
SvaraRaderaDu har skrivt om man får ett kvoten värde mindre än 1,8 detta betyder att man inte ska få en ren plasmid ( det finns protien). Min fråga är om man får ett kvoten värde högre än 1,8 vad skulle detta betyder?? DNA koncentration står inte i din blogg också kqn du lägga den??
Vänliga hälsningar
Ali Azeez
Hej Ali!
RaderaOm kvoten är över 2,0 kan detta betyda att plasmidlösningen innehåller mycket DNA. En "rimligt" kvot ligger i intervallen 1,6 - 2,0.
Visst, jag glömde att skriva min koncentration. Den är 0,28 mikrog./mikrol.
Diana
Hej Diana,
SvaraRaderadu skriver att ni inte vet hur mycket plasmid ni har fått. Hur menar du då? Ni beräknade ju en koncentration, jag håller med Ali att det vore intressant att veta den. Vi hoppas ju att det är koncentrationen av din plasmid, vad är det som skulle kunna göra att värdet du fått inte motsvarar koncentration av plasmid? Kan Diana eller någon annan svara på det?
Märit
Hej Märit,
RaderaDet jag menar är att vi inte vet hur mycket att det vi har fått är ren plasmid DNA, eller att det kan finnas rester av den kromosomala DNA.
Om koncentration av plasmid lösningen skulle vara över 0,3 μg/ μl, kan detta betyda att erhållen resultat motsvarar inte koncentration av plasmiden eftersom den är för hög.
Min beräknade koncentration är 0,28 μg/μl.
Diana
Bra!
RaderaHej, Diana.
SvaraRaderaJag ville bara kommentera att den upmätta absorbansen vid 260 nm används för att koncentrationsbestämma så den vore bra att ha med i inlägget. Annars är har du skrivit ett bra inlägg. /Emre